Structural and functional characterization of the protein PDZD7 as part of the Usher2 complex - Récepteurs Canaux - Channel Receptors
Thèse Année : 2022

Structural and functional characterization of the protein PDZD7 as part of the Usher2 complex

Caractérisation structurale et fonctionnelle de la protéine PDZD7 au sein du complexe Usher2

Résumé

Hearing relies on the capacity of specialized sensory hair cells in the cochlea to transduce sound-induced vibrations into electrical signals that are transmissible to the brain. Hair cells possess actin-filled stereocilia structured into staircase-shaped bundles deflected by sound-waves. Large protein complexes are found at the anchoring sites of extracellular links that interconnect stereocilia. Mutations of these proteins are responsible for hereditary sensory diseases, notably the Usher syndromes. The Usher syndrome of type 2 (Usher 2) is the most common form genetic cause of combined congenital deafness and progressive blindness. The Usher 2 protein complex, involved in the morphogenesis of the hair bundles, encompasses two large transmembrane proteins, usherin and the G protein-coupled receptor (GPCR) ADGRV1, with very large extracellular domains forming fibrous links between the stereocilia. These two proteins possess a cytoplasmic region in interaction with the scaffolding proteins whirlin and PDZD7, which in turn associate to actin-binding proteins. Usher proteins contain numerous protein-protein interaction domains necessary to the intricacy of the network, but the network’s assembly remains elusive, thus leaving the effect of mutations detected in patients to speculation. In this project, I studied the Usher 2 complex components from the molecules (in silico and in vitro) to the complex assembly at the cellular level. First, I deeply analyzed the sequences of the orphan domain family HHD, found in few neuronal proteins, using bioinformatics tools to predict functional surfaces involved in protein-protein interactions and the effect of human pathogenic mutations. Then, I characterized the determinants of interaction between the adhesion GPCR ADGRV1 and its PDZ-domain containing regulator PDZD7. I showed that the two N-terminal PDZ domains of PDZD7 are able to interact with ADGRV1 PDZ binding motif, with a higher affinity for the second PDZ. This interaction requires C-terminal extension of the PDZ domains which likely adopts a beta strand conformation in solution. I showed that two human pathological mutations of PDZD7 PDZ domains trigger a drastic decrease of affinity for ADGRV1, potentially disrupting the Usher2 complex. To further understand the activation mechanism of ADGRV1, I started its structural characterization in complex with its associated G protein by cryo electron microscopy. At the cellular level, I used high resolution STED microscopy to decipher the accurate localization of the Usher 2 complex and its anisotropic distribution between hair cell stereocilia rows. Finally, I initiated an ambitious cryo electron tomography project to solve the general organization of the Usher 2 complex in situ. To this end, I optimized the cochlea preparation for cryo-Correlative Light and Electron Microscopy Focused Ion Beam milling (cryo-CLEM FIB milling) and performed the first lift-out procedure on mouse dissected cochlea. Altogether, the obtained results will help to understand the physiopathology of mutations associated to the Usher syndrome of type 2.
L’audition repose sur la transduction, par les cellules sensorielles de la cochlée, des ondes sonores en signaux électriques alors transmis au cerveau. Ces cellules, dites ciliées, possèdent des touffes de stéréocils d’actine organisés en rangées de taille croissante. De larges complexes protéiques sont trouvés aux sites d’ancrage de liens extracellulaires connectant ces stéréocils entre eux. Des mutations dans ces protéines induisent des maladies sensorielles héréditaires, notamment le syndrome Usher. Le syndrome Usher de type 2 (Usher 2) est la première cause de surdité congénitale associée à une cécité chez l’Homme. Le complexe protéique Usher 2, impliqué dans le développement des touffes ciliaires, est composé de deux protéines transmembranaires, l’usherine et ADGRV1, qui possèdent de larges domaines extracellulaires formant des liens fibreux à la base des stéréocils. Ces deux protéines ont un domaine intracellulaire en interaction avec les protéines d’échafaudage whirline et PDZD7, qui interagissent à leur tour avec des protéines de liaison à l’actine. Les protéines Usher possèdent de multiples domaines d’interaction protéine-protéine nécessaires à la formation de complexes, mais l’organisation générale du réseau reste largement inconnue, ce qui ne permet pas d’interpréter l’effet de mutations Usher. Dans ce projet de thèse, j’ai étudié le complexe Usher 2 depuis l’échelle moléculaire (in silico et in vitro) jusqu’à l’échelle cellulaire. J’ai en premier lieu analysé les séquences protéiques de la famille de domaines HHD, exprimés seulement dans quelques protéines neuronales, en utilisant des outils bioinformatiques afin de prédire la fonction de différentes surfaces dans des interactions protéine-protéine ainsi que l’effet de mutations pathogènes humaines. Par la suite, je me suis intéressé aux déterminants d’interaction entre le récepteur d’adhésion couplé aux protéines G (RCPG) ADGRV1 et sa protéine régulatrice à domaine PDZ PDZD7. J’ai ainsi montré que les deux domaines N-terminaux de PDZD7 interagissent avec le PBM d’ADGRV1, avec une meilleure affinité pour le second PDZ. Cette interaction requiert la présence d’extensions C-terminales dans les deux domaines PDZ. Ces extensions adoptent une structure en brins beta. J’ai montré que des mutations de PDZD7 provoquent une perte drastique d’affinité pour ADGRV1, dissociant potentiellement le complexe Usher 2. Afin de mieux comprendre les mécanismes d’activation d’ADGRV1, j’ai entamé l’étude structurale du complexe RCPG/protéine G par cryo-microscopie électronique. A l’échelle cellulaire, j’ai utilisé la microscopie de fluorescence à haute résolution STED afin de décrire la distribution du complexe Usher 2 entre les différents stéréocils des cellules ciliées. Enfin, j’ai entamé un projet ambitieux de cryo-microscopie électronique en tomographie visant à déterminer l’organisation générale du complexe Usher 2 in situ, dans l’organe de l’audition. J’ai ainsi optimisé la préparation d’échantillon pour « cryo-Correlative Light and Electron Microscopy Focused Ion Beam milling (cryo-CLEM FIB milling) » et réalisé le premier prélèvement d’une lamelle de cochlée de souris disséquée. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre la physiopathologie des mutations associées au syndrome Usher de type 2.
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  • HAL Id : tel-04711626 , version 1

Citer

Baptiste Colcombet-Cazenave. Structural and functional characterization of the protein PDZD7 as part of the Usher2 complex. Structural Biology [q-bio.BM]. Sorbonne Université, 2022. English. ⟨NNT : 2022SORUS323⟩. ⟨tel-04711626⟩
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